脊（jǐ）髓性肌（jī）萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常（cháng）染色体隐性遗传病（bìng），居儿童致死性常染色（sè）体隐性遗传（chuán）病的（de）第2位（wèi）。位于（yú）染色体5q11.2～q13.3上的运动神经元存（cún）活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病（bìng）基因。

　　人基因（yīn）组有（yǒu）两个紧邻的（de）高度同源的（de）SMN基（jī）因（yīn）：端粒侧的（de）SMN1和着丝（sī）粒（lì）侧的（de）SMN2，两者仅（jǐn）有5个（gè）碱基不同。SMN1是主要功能基因，该基因突（tū）变可导致SMA发（fā）病，SMN2为临床表型的（de）调节基因，影响病情（qíng）的严重程度，其拷（kǎo）贝数（shù）增（zēng）加可减轻SMA表（biǎo）型。目前已知约94％的SMA患者为SMN1基因第7和（或）第（dì）8外显子纯合缺失所（suǒ）致，少数病例可由SMN1基（jī）因点（diǎn）突（tū）变或小的缺失（shī）引起。

　　SMN1基因外（wài）显（xiǎn）子缺（quē）失检测的（de）意（yì）义

　　SMA在人群（qún）中的发病率为1/5000～1/10000，群（qún）体携带（dài）者频（pín）率为1/35～1/50，是出生缺陷的高（gāo）危因素，因此极有必（bì）要进行SMA携带（dài）者的人群筛（shāi）查，并通过产前诊断技（jì）术（shù）降低人群中SMA患儿（ér）的出生率。

　　临床（chuáng）上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和（hé）Ⅲ型，即婴儿型、中间型和少年（nián）型（xíng），严重程度（dù）依次递（dì）减。神经专科（kē）医生一般根据（jù）患者发病年龄、临床表现及（jí）病情进展程度进行临床诊断（duàn），辅助检查方（fāng）法包（bāo）括肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族史和（hé）SMN1基（jī）因分（fèn）析可进行确诊（zhěn）。由于SMA患儿中约（yuē）94%为SMN1基因外（wài）显子纯合缺（quē）失，因此，SMN1基因缺失检测对于（yú）SMA的诊断具有更高的灵敏度和特异（yì）性。且对（duì）不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失（shī）率没（méi）有（yǒu）显著差异（yì），所以，SMN1纯合缺失的检测对（duì）于不同型SMA患者具（jù）有相同（tóng）的（de）临床诊断（duàn）价值。在（zài）欧美人群中，SMN1基因纯合缺失检测（cè）已成为（wéi）诊断和排（pái）除诊断（duàn）SMA的（de）首选方法。

　　SMN1基因缺失检（jiǎn）测试剂的现状

　　目前，SMN1基因外显（xiǎn）子（zǐ）缺（quē）失检（jiǎn）测试剂较（jiào）为缺乏，临床（chuáng）检验实（shí）验室较为公认的方法是PCR结合限制（zhì）性片段长度多态性（PCR-RFLP）的（de）方（fāng）法。但该方法（fǎ）操作较为繁（fán）琐，且重（chóng）复性差（chà），不利于标准化，不易（yì）推广。同时，这（zhè）种方法只能（néng）检测出纯合缺失，无法确认杂合缺（quē）失。

　　荷兰的SMAMLPA检（jiǎn）测试剂可对待（dài）测靶序列进（jìn）行半定量分（fèn）析（xī），因此既可检测纯合缺失，亦可确认杂合缺失（shī）。在（zài）国内外已有多篇文献（xiàn）报道（dào）采用该（gāi）方法进行SMA患者诊断和（hé）SMA携带者筛查。但该产品目（mù）前仍为（wéi）“仅用于（yú）研究（jiū）”的试（shì）剂，尚未（wèi）按照体外诊断类医疗（liáo）器（qì）械（xiè）上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国（guó）家食品药品监管总局批（pī）准了第一项（xiàng）SMN1缺失突变检测试剂（jì）上市。该产品（pǐn）采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单（dān）拷贝基因RPP40为内（nèi）参基因，对SMN1基（jī）因第7外显子和第8外显（xiǎn）子拷贝数进（jìn）行（háng）相对定量（liàng）检测，用于SMA患者（zhě）的体外辅助分子诊断。SMN1基因外显子（zǐ）缺失（shī）检测的难点之一（yī）在于排（pái）除高同源（yuán）性基因SMN2的（de）干扰，特别是对于SMN2高（gāo）拷贝数（shù）的受试者，需保证结果的准确（què）可（kě）靠。该（gāi）产品通过对（duì）实时（shí）荧光PCR相对（duì）定量（liàng）、绝对定量技术进行（háng）系统整合，并在反应体系中（zhōng）加入特定化学组分，以（yǐ）抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的（de）错配（pèi），增加PCR扩增的特异（yì）性，从（cóng）而有效控制SMN2基因非特（tè）异性（xìng）扩增对检测结果的影（yǐng）响，准（zhǔn）确检（jiǎn）出高（gāo）拷（kǎo）贝（bèi）数SMN2样本中SMN1基（jī）因第（dì）7和第8外显子（zǐ）的（de）缺失情（qíng）况（kuàng）。

　　鉴于国内外尚（shàng）无任何按照体外诊断试剂批（pī）准上（shàng）市的SMA分子诊断产（chǎn）品，因（yīn）此临床（chuáng）试验方案中（zhōng）依据（jù）EMQN关（guān）于《SMA分子诊断最佳实践指南（nán）》，采用了国（guó）内外（wài）SMA体外辅助分子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床试（shì）验共完成（chéng）1069例，其（qí）中正（zhèng）常对照组777例，SMA病（bìng）例组292例（lì），统计分析（xī）结果显示申报产品与对比方法检测结果的一（yī）致性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例（lì）正（zhèng）常成年（nián）人（rén）大样本（běn）中目标外显子△△Ct分布范围（wéi）的调查亦显示，该产品的（de）纯（chún）合突变判断界值设置合理。

　　该（gāi）试剂目（mù）前批准的预期用（yòng）途仅（jǐn）包含纯合缺失的检测（cè），尚不（bú）能用（yòng）于杂合（hé）缺失的检测，因此无法用于SMA携带（dài）者的筛查，这是该产品的（de）缺（quē）陷之一。

　　事实上，该产品在设（shè）计上已考虑到SMA携带者的检测，其（qí）检（jiǎn）测原理是以待测样本中目标外显子荧光（guāng）信号Ct值与内（nèi）参基（jī）因荧光信号（hào）Ct值之差（△Ct_s），与正常对照品三个梯度（dù）稀（xī）释品（pǐn）中目标外显（xiǎn）子荧光信号Ct值（zhí）和（hé）内参基因荧（yíng）光信号Ct值之差的平（píng）均值（zhí）（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为（wéi）待测（cè）样本（běn）中目（mù）标外显子（zǐ）拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实（shí）时荧光定（dìng）量PCR相对定量的基本（běn）数学原理推导得到申报产（chǎn）品检测变量△△Ct的计算公式，依据（jù）这一计算公式可（kě）推导（dǎo）出纯合缺失、杂合（hé）缺失和野生型的（de）△△Ct理（lǐ）论值（或范围）；再（zài）结（jié）合（hé）目标（biāo）外显子与（yǔ）内参基因扩增效率差异以（yǐ）及（jí）SMN2不（bú）同（tóng）拷贝数的影响，可对上（shàng）述△△Ct理论值（zhí）进行优（yōu）化（huà）。结果显（xiǎn）示纯合缺失、杂（zá）合缺失和野生（shēng）型的△△Ct值（或范围）之间可设置（zhì）合理的判断界值，因（yīn）此理论上该（gāi）产品可分（fèn）别检测出三种基因状态。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研（yán）究尚不透彻，再（zài）加上（shàng）缺（quē）乏可判定杂合缺失（shī）的对比方法等其他困（kùn）难，本次注册申请的预期用途仅限于检测纯合（hé）突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基（jī）因外显子缺失检（jiǎn）测在SMA疾病诊断和SMA携带者（zhě）筛查中（zhōng）具有重要（yào）的（de）临床价值（zhí）。然而到（dào）目前为止，受（shòu）到技术水平的限制，相关的体（tǐ）外诊断试（shì）剂比较（jiào）缺乏（fá），特别是可用于SMA携带者筛查的杂（zá）合缺（quē）失检（jiǎn）测，尚（shàng）无适合的体外诊断试剂上市。（器审（shěn）中心审（shěn）评六部  何（hé）静云）

来源：中（zhōng）国医药（yào）报